放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受照剂量估算标准
规定放射工作人员职业健康检查及受照剂量估算中外周血淋巴细胞微核相关的标本制备、检测、结果评价、剂量估算和质量控制;适用范围包括职业健康检查微核检测及急性全身外照射受照人员剂量估算。;以下逐页列出原文,并另列公式、表格与图示证据。
标准解读
封面与版本信息(PDF物理页1)
ICS 13.100 CCS C 60 GBZ 中华人民共和国家职业卫生标准 GBZ/T 328—2023 代替 WS/T 187—1999 放射工作人员职业健康检查外周血淋巴 细胞微核检测方法与受照剂量估算标准 Standard for the method of micronucleus detection in lymphocytes on occupational health examination for radiation workers and exposure dose estimation 2023 - 03 - 07 发布 2023 - 09 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布
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目录(PDF物理页2)
GBZ/T 328—2023 I 目 次 前言 ............................................................................. II 1 范围 ........................................................................... 1 2 规范性引用文件 ................................................................. 1 3 术语和定义 ..................................................................... 1 4 标本采集与微量全血培养 ......................................................... 2 5 微核标本制备 ................................................................... 2 6 微核分析 ....................................................................... 2 7 检测结果判断 ................................................................... 3 8 检测报告与归档 ................................................................. 3 9 剂量-效应标准曲线的建立 ........................................................ 3 10 剂量估算 ...................................................................... 4 11 质量控制 ...................................................................... 5 12 CB 微核法估算剂量的原则 ........................................................ 5 附录A(规范性) 主要仪器设备和试剂配制 ........................................... 6 附录B(资料性) 微核分析记录表和微核检测报告单 ................................... 7 附录C(资料性) 放射事故受照人员生物剂量估算应用示例 ............................. 9 附录D(规范性) 正确使用本标准的说明 ............................................ 10 参考文献 ......................................................................... 11
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前言(PDF物理页3)
GBZ/T 328—2023 II 前 言 本标准代替WS/T 187—1999《淋巴细胞微核估算受照剂量方法》。与WS/T 187—1999相比,除结构 调整和编辑性改动外,主要技术变化如下: a) 在范围中增加了“放射工作人员职业健康检查和受照剂量估算中,外周血淋巴细胞微核的标 本制备、微核检测、结果评价、剂量估算方法和质量控制。”适用范围增加了“放射工作人 员职业健康检查微核检测”(见第1 章); b) 增加了规范性引用文件(见第2 章); c) 术语和定义中删除了“生物剂量计”和“松胞素-B”(见WS/T 187—1999 的2.1 和2.5), 增加了“生物剂量估算”“常规培养微核法” 和“微核率”(见3.1、3.3 和3.6),更改了 “微核”(见3.2,见WS/T 187—1999 的2.3) d) 删除了“剂量-效应曲线的建立方法”(见WS/T 187—1999 的第3 章); e) 增加了“标本采集与微量全血培养”“微核标本制备”“微核分析”“检测结果判断”“检 测报告与归档”“剂量-效应标准曲线的建立”“剂量估算”和“质量控制”(见第4 章~第 11 章); f) 更改了“CB 微核法估算受照剂量的原则”(见第12 章,WS/T 187—1999 的第4 章); g) 更改了正确使用本标准的说明(见附录D,WS/T 187—1999 的附录A); h) 增加了附录A 主要仪器设备和试剂配制(见附录A); i) 增加了附录B 微核分析记录表和微核检测报告单(见附录B); j) 增加了附录C 放射事故受照人员生物剂量估算应用示例(见附录C); k) 增加了参考文献。 本标准由国家卫生健康标准委员会放射卫生标准专业委员会负责技术审查和技术咨询,由中国疾病 预防控制中心负责协调性和格式审查,由国家卫生健康委职业健康司负责业务管理、法规司负责统筹管 理。 本标准起草单位:中国医学科学院放射医学研究所、中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学 所、河南省职业病防治研究院、苏州大学。 本标准主要起草人:刘强、刘青杰、吕玉民、郝建秀、王彦、李爽、韩林、陈娜、李旭光、姜恩海。 本标准于1999年首次发布为WS/T 187—1999,本次为第一次修订。
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原文条款与附录(PDF物理页4)
GBZ/T 328—2023 1 放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞微核检测方法与受 照剂量估算标准 1 范围 本标准规定了放射工作人员职业健康检查和受照剂量估算中,外周血淋巴细胞微核的标本制备、微 核检测、结果评价、剂量估算方法和质量控制。 本标准适用于放射工作人员职业健康检查微核检测和急性全身外照射受照人员的剂量估算。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本标准;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 标准。 GBZ/T 248 放射工作人员职业健康检查外周血淋巴细胞染色体畸变检测与评价 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 生物剂量估算 biological dose estimation 用具有稳定剂量-效应关系的分子或亚细胞结构变化等生物学指标定量估算受照射个体的辐射吸收 剂量的方法。 3.2 微核 micronucleus 由于基因组DNA损伤导致细胞分裂后期滞后的染色体断片、一个或多个染色体不能随有丝分裂进入 子细胞,而在细胞质中形成直径小于主核的三分之一且完全与主核分开的圆形或椭圆形小核。 3.3 常规培养微核法 routine micronucleus method 采用微量全血培养法培养淋巴细胞,培养结束后经低渗、固定、制片和染色进行观察和分析微核的 方法。 3.4 胞质分裂阻断微核法 cytokinesis-block micronucleus method CB 微核法 在培养的淋巴细胞完成第一次有丝分裂前,向培养体系中加入松胞素-B,阻滞胞质分裂,培养结束 后经低渗、固定、制片和染色,只计数和分析双核淋巴细胞中微核的方法。 3.5 微核细胞 micronucleus cell 如采用常规培养微核法,指胞质中含有微核的转化淋巴细胞;如采用CB微核法,指胞质中含有微核 的双核淋巴细胞。 3.6 微核率 micronucleus frequency 如采用常规培养微核法,指每1000个转化的淋巴细胞中含有的微核数;如采用CB微核法,指每1000 个双核淋巴细胞中含有的微核数。
- 3.1 生物剂量估算 biological dose estimation 用具有稳定剂量-效应关系的分子或亚细胞结构变化等生物学指标定量估算受照射个体的辐射吸收 剂量的方法。
- 3.2 微核 micronucleus 由于基因组DNA损伤导致细胞分裂后期滞后的染色体断片、一个或多个染色体不能随有丝分裂进入 子细胞,而在细胞质中形成直径小于主核的三分之一且完全与主核分开的圆形或椭圆形小核。
- 3.3 常规培养微核法 routine micronucleus method 采用微量全血培养法培养淋巴细胞,培养结束后经低渗、固定、制片和染色进行观察和分析微核的 方法。
- 3.4 胞质分裂阻断微核法 cytokinesis-block micronucleus method CB 微核法 在培养的淋巴细胞完成第一次有丝分裂前,向培养体系中加入松胞素-B,阻滞胞质分裂,培养结束 后经低渗、固定、制片和染色,只计数和分析双核淋巴细胞中微核的方法。
- 3.5 微核细胞 micronucleus cell 如采用常规培养微核法,指胞质中含有微核的转化淋巴细胞;如采用CB微核法,指胞质中含有微核 的双核淋巴细胞。
- 3.6 微核率 micronucleus frequency 如采用常规培养微核法,指每1000个转化的淋巴细胞中含有的微核数;如采用CB微核法,指每1000 个双核淋巴细胞中含有的微核数。
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GBZ/T 328—2023 2 3.7 剂量-效应曲线 dose-effect curve 描述生物效应依赖于剂量变化方式的曲线。 4 标本采集与微量全血培养 主要仪器和试剂配制 4.1 主要仪器和试剂配制参见附录A。 外周静脉血采集 4.2 采集静脉血约2 mL,肝素抗凝,颠倒混匀,静脉血保存最佳温度是18 ℃~24 ℃,72 h内送达实验室。 微量全血培养步骤 4.3 4.3.1 将采集的静脉血0.3 mL~0.5 mL 加入4 mL~5 mL 含植物血凝素和10%~20%胎牛血清的洛斯维帕 克纪念研究所-1640(RPMI-1640)培养基中,在培养容器上编号并注明培养开始时间和日期,轻轻摇匀, 37 ℃±0.5 ℃恒温培养。 4.3.2 如采用常规培养微核法,培养至68 h~72 h 收获细胞。 4.3.3 如采用胞质分裂阻断微核法,培养至40 h~44 h,加入松胞素-B,使其终浓度为6 μg/mL,继 续培养至72 h 收获细胞。 5 微核标本制备 低渗 5.1 吸弃培养液上清,摇匀,每管加入4 mL 37℃预温的KCl低渗液(常规培养法低渗液浓度宜为0.075 mol/L,CB微核法低渗液浓度宜为0.1 mol/L),轻轻吹打均匀,立即加入新配制的固定液0.5 mL~1 mL (甲醇:冰醋酸体积比3:1),混匀,移至10 mL~15 mL离心管中,水平离心机离心8 min~10 min,离 心力为200 g~250 g。 固定 5.2 弃上清,摇匀,加入4.5 mL固定液,固定20 min~30 min,水平离心机离心8 min~10 min,离心力 为200 g~250 g。离心后可用固定液洗涤细胞,以减少细胞悬液中的杂质。 制片 5.3 弃上清,视细胞数量酌情加入固定液数滴,充分混匀,将细胞悬液均匀滴在洁净干燥载玻片上,室 温干燥。 编号 5.4 对每一张微核标本玻片进行编号,并做好记录。 染色 5.5 用体积比为8%~10%的瑞氏-吉姆萨染液或吉姆萨染液染色8 min~10 min,轻轻冲洗,室温干燥。 6 微核分析 阅片 6.1
- 3.7 剂量-效应曲线 dose-effect curve 描述生物效应依赖于剂量变化方式的曲线。 4 标本采集与微量全血培养 主要仪器和试剂配制
- 4.1 主要仪器和试剂配制参见附录A。 外周静脉血采集
- 4.2 采集静脉血约2 mL,肝素抗凝,颠倒混匀,静脉血保存最佳温度是18 ℃~24 ℃,72 h内送达实验室。 微量全血培养步骤
- 4.3
- 4.3.1 将采集的静脉血0.3 mL~0.5 mL 加入4 mL~5 mL 含植物血凝素和10%~20%胎牛血清的洛斯维帕 克纪念研究所-1640(RPMI-1640)培养基中,在培养容器上编号并注明培养开始时间和日期,轻轻摇匀, 37 ℃±0.5 ℃恒温培养。
- 4.3.2 如采用常规培养微核法,培养至68 h~72 h 收获细胞。
- 4.3.3 如采用胞质分裂阻断微核法,培养至40 h~44 h,加入松胞素-B,使其终浓度为6 μg/mL,继 续培养至72 h 收获细胞。 5 微核标本制备 低渗
- 5.1 吸弃培养液上清,摇匀,每管加入4 mL 37℃预温的KCl低渗液(常规培养法低渗液浓度宜为0.075 mol/L,CB微核法低渗液浓度宜为0.1 mol/L),轻轻吹打均匀,立即加入新配制的固定液0.5 mL~1 mL (甲醇:冰醋酸体积比3:1),混匀,移至10 mL~15 mL离心管中,水平离心机离心8 min~10 min,离 心力为200 g~250 g。 固定
- 5.2 弃上清,摇匀,加入4.5 mL固定液,固定20 min~30 min,水平离心机离心8 min~10 min,离心力 为200 g~250 g。离心后可用固定液洗涤细胞,以减少细胞悬液中的杂质。 制片
- 5.3 弃上清,视细胞数量酌情加入固定液数滴,充分混匀,将细胞悬液均匀滴在洁净干燥载玻片上,室 温干燥。 编号
- 5.4 对每一张微核标本玻片进行编号,并做好记录。 染色
- 5.5 用体积比为8%~10%的瑞氏-吉姆萨染液或吉姆萨染液染色8 min~10 min,轻轻冲洗,室温干燥。 6 微核分析 阅片
- 6.1
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GBZ/T 328—2023 3 盲法阅片。按显微镜载物台刻度坐标,从右至左逐列或逐行对每张微核标本玻片进行扫描式阅片, 常规培养微核法寻找转化的单核淋巴细胞,如果采用CB微核法,即寻找双核淋巴细胞,对每位受检者至 少分析1000个转化淋巴细胞。 双核淋巴细胞的判定标准 6.2 细胞应为双核细胞,同一个双核细胞中的两个细胞核应具有各自完整的核膜,并位于相同的细胞质 边界内,两个细胞核大小、质感和染色强度应大致相等,两个细胞核完全分离,或者可由一个或多个核 质桥连接,核质桥不超过核直径的1/4,两个细胞核重叠时,应看到各自的完整核膜。双核细胞的细胞 质边界或细胞膜应完整,并与相邻细胞的细胞质边界明显区分。 微核的判定标准 6.3 微核应游离于胞质中,与主核完全分开,直径为主核的1/16~1/3,与主核不连接,不重叠(重叠 或相切时,应看到各自的完整核膜),无折光性,与染料颗粒等杂质相区别,着色深浅与主核相同或略 浅。 分析和记录 6.4 常规培养微核法观察转化的单核淋巴细胞,CB微核法观察双核淋巴细胞,如发现微核,应在微核分 析记录表中记录显微镜坐标,有条件的机构可拍照,在微核分析记录表中记录图片文件名,以备复核。 微核分析记录表样式参见附录B。 7 检测结果判断 常规培养法微核率的正常参考值范围0~6‟;CB 法微核率的正常参考值范围0~30‟。 7.1 对检测结果超出正常参考值范围者,可检查外周血淋巴细胞染色体畸变。 7.2 8 检测报告与归档 对每位受检者应出具外周血微核检测报告单。检测报告单样式参见附录B。 8.1 检测的微核标本应保存两年。微核记录表等原始资料应建档长期保存,并建立电子档案。 8.2 9 剂量-效应标准曲线的建立 样品要求 9.1 采血前应获取志愿者的知情同意。志愿者2名~4名健康成年人,非放射工作者,男女各半,年龄在 18岁~60岁,无烟酒嗜好,半年内无急慢性疾病史、无射线和化学毒物接触史,近一个月内无病毒感染 史。抽取静脉血6 mL~8 mL,注入肝素抗凝管。 照射、培养和分析 9.2 9.2.1 应提供可靠的、明确的照射样品的物理剂量。受照样品应与照射源保持一定的距离以达到均匀 照射的目的。有条件的实验室应建立包括不同辐射类型(如X 射线、γ 射线、中子)、不同剂量率(低LET 辐射)的剂量-效应标准曲线。对于低LET 辐射,剂量范围选择0.25 Gy~5.0 Gy,剂量率介于0.3 Gy/min~ 1.O Gy/min 之间,选择不少于8 个剂量点,其中,0.25 Gy~1.0 Gy 范围内刻度曲线的剂量点不少于4 个。剂量点可选择0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy、1.0 Gy、2.0 Gy、3.0 Gy、4.0 Gy 和5.0 Gy。对于高 LET 辐射,剂量范围选择0.05 Gy~3.0 Gy,剂量点可选择0.05 Gy、0.1 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy、1.5 Gy、 2.0 Gy、2.5 Gy 和3.0 Gy。 9.2.2 培养方法同本标准第4 章。 9.2.3 微核标本制备、分析和记录按照本标准第5 章和第6 章中所述方法进行。 9.2.4 按照公式(1)计算各剂量点应分析的细胞数。
- 6.2 细胞应为双核细胞,同一个双核细胞中的两个细胞核应具有各自完整的核膜,并位于相同的细胞质 边界内,两个细胞核大小、质感和染色强度应大致相等,两个细胞核完全分离,或者可由一个或多个核 质桥连接,核质桥不超过核直径的1/4,两个细胞核重叠时,应看到各自的完整核膜。双核细胞的细胞 质边界或细胞膜应完整,并与相邻细胞的细胞质边界明显区分。 微核的判定标准
- 6.3 微核应游离于胞质中,与主核完全分开,直径为主核的1/16~1/3,与主核不连接,不重叠(重叠 或相切时,应看到各自的完整核膜),无折光性,与染料颗粒等杂质相区别,着色深浅与主核相同或略 浅。 分析和记录
- 6.4 常规培养微核法观察转化的单核淋巴细胞,CB微核法观察双核淋巴细胞,如发现微核,应在微核分 析记录表中记录显微镜坐标,有条件的机构可拍照,在微核分析记录表中记录图片文件名,以备复核。 微核分析记录表样式参见附录B。 7 检测结果判断 常规培养法微核率的正常参考值范围0~6‟;CB 法微核率的正常参考值范围0~30‟。
- 7.1 对检测结果超出正常参考值范围者,可检查外周血淋巴细胞染色体畸变。
- 7.2 8 检测报告与归档 对每位受检者应出具外周血微核检测报告单。检测报告单样式参见附录B。
- 8.1 检测的微核标本应保存两年。微核记录表等原始资料应建档长期保存,并建立电子档案。
- 8.2 9 剂量-效应标准曲线的建立 样品要求
- 9.1 采血前应获取志愿者的知情同意。志愿者2名~4名健康成年人,非放射工作者,男女各半,年龄在 18岁~60岁,无烟酒嗜好,半年内无急慢性疾病史、无射线和化学毒物接触史,近一个月内无病毒感染 史。抽取静脉血6 mL~8 mL,注入肝素抗凝管。 照射、培养和分析
- 9.2
- 9.2.1 应提供可靠的、明确的照射样品的物理剂量。受照样品应与照射源保持一定的距离以达到均匀 照射的目的。有条件的实验室应建立包括不同辐射类型(如X 射线、γ 射线、中子)、不同剂量率(低LET 辐射)的剂量-效应标准曲线。对于低LET 辐射,剂量范围选择0.25 Gy~5.0 Gy,剂量率介于0.3 Gy/min~ 1.O Gy/min 之间,选择不少于8 个剂量点,其中,0.25 Gy~1.0 Gy 范围内刻度曲线的剂量点不少于4 个。剂量点可选择0.25 Gy、0.5 Gy、0.75 Gy、1.0 Gy、2.0 Gy、3.0 Gy、4.0 Gy 和5.0 Gy。对于高 LET 辐射,剂量范围选择0.05 Gy~3.0 Gy,剂量点可选择0.05 Gy、0.1 Gy、0.5 Gy、1.0 Gy、1.5 Gy、
- 2.0 Gy、2.5 Gy 和3.0 Gy。
- 9.2.2 培养方法同本标准第4 章。
- 9.2.3 微核标本制备、分析和记录按照本标准第5 章和第6 章中所述方法进行。
- 9.2.4 按照公式(1)计算各剂量点应分析的细胞数。
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GBZ/T 328—2023 4 𝑛= (1−𝑝)×96.04 𝑝 ········································································· (1) 式中: n——应分析的细胞数; p——微核率,可在计数分析一定数量的细胞后求得。 剂量-效应标准曲线拟合 9.3 对X或γ射线诱导的微核与受照射剂量之间的剂量-效应关系以拟合一次方程或二次多项式为宜,按 照公式(2)或公式(3)进行拟合。 a) 一次方程模式 y = 𝑎+ 𝑏𝐷………………………………………………… ( (2) 式中: y——微核率,(‟); a——本底微核率; b——回归系数; D——吸收剂量,单位为戈瑞(Gy)。 b) 二次多项式模式 y = 𝑎+ 𝑏𝐷+ 𝑐𝐷2………………………………………… ( (3) 式中: y——微核率,(‟); a——本底微核率; b——回归系数; D——吸收剂量,单位为戈瑞(Gy); c——回归系数。 10 剂量估算 微核标本的制备 10.1 所要估算剂量样品的微核标本制备方法均应与建立剂量-效应曲线的方法相同。 微核率、微核率的不确定度的计算 10.2 当分析细胞数足够多时(一般要求≥1000),微核检测值符合泊松分布,微核率和微核率的不确定 度分别按照公式(4)和公式(5)计算: 𝑝= 𝑥 𝑛×1000‰……………………………………………(4) 式中: p——微核率,(‰); x——检测到的微核数; n——分析的细胞数。 𝑢(𝑝) = √ 𝑝 𝑛×1000‰…………………………………………(5) 式中: 𝑢(p)——微核率的不确定度,(‰); p——微核率,(‰);
- 9.3 对X或γ射线诱导的微核与受照射剂量之间的剂量-效应关系以拟合一次方程或二次多项式为宜,按 照公式(2)或公式(3)进行拟合。 a) 一次方程模式 y = 𝑎+ 𝑏𝐷………………………………………………… ( (2) 式中: y——微核率,(‟); a——本底微核率; b——回归系数; D——吸收剂量,单位为戈瑞(Gy)。 b) 二次多项式模式 y = 𝑎+ 𝑏𝐷+ 𝑐𝐷2………………………………………… ( (3) 式中: y——微核率,(‟); a——本底微核率; b——回归系数; D——吸收剂量,单位为戈瑞(Gy); c——回归系数。 10 剂量估算 微核标本的制备
- 10.1 所要估算剂量样品的微核标本制备方法均应与建立剂量-效应曲线的方法相同。 微核率、微核率的不确定度的计算
- 10.2 当分析细胞数足够多时(一般要求≥1000),微核检测值符合泊松分布,微核率和微核率的不确定 度分别按照公式(4)和公式(5)计算: 𝑝= 𝑥 𝑛×1000‰……………………………………………(4) 式中: p——微核率,(‰); x——检测到的微核数; n——分析的细胞数。 𝑢(𝑝) = √ 𝑝 𝑛×1000‰…………………………………………(5) 式中: 𝑢(p)——微核率的不确定度,(‰); p——微核率,(‰);
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GBZ/T 328—2023 5 n——分析的细胞数。 微核率的置信限计算 10.3 置信水平为95%时,微核率的置信限按照公式(6)计算: 95%置信水平微核率的置信限= 𝑝± 1.96𝑢(𝑝)…………………………………………… ( (6) 式中: p——微核率,(‟); 𝑢(𝑝)——微核率的不确定度,(‰)。 当置信限下限<0时,覆盖区间下限默认为0。 受照剂量的估算 10.4 将所要估算剂量的标本中得到的微核率及95%置信限的上下限代入建立的剂量-效应标准曲线,估算 出受照剂量。放射事故受照人员生物剂量估算示例参见附录C。 11 质量控制 进行微核标本制备与分析的实验室应有2 名(含)以上专业技术人员,掌握电离辐射生物效应和 11.1 细胞遗传学基础知识,熟练掌握显微镜下微核分析技术。每个微核需2 名专业技术人员相互确认。 标本应有唯一性编号,标本分析完毕后,应置于玻片盒内保存,并做好记录。 11.2 分析细胞数应满足本标准第6.1 条的要求。 11.3 正确使用本标准的说明参见附录D。 11.4 12 CB 微核法估算剂量的原则 事故后应尽早取血,不宜超过4 周。 12.1 培养条件、制片方法和微核的判断标准应与建立剂量-效应曲线时相同。对估算剂量的个体,至 12.2 少应分析500 个以上的双核淋巴细胞。对受照剂量较大的个体,如达不到上述细胞数,可全片计数所有 双核淋巴细胞。 应选择和事故条件接近的刻度曲线进行剂量估算,在曲线剂量范围内应用,不应外推。 12.3 估算剂量时,除给出平均值以外,同时给出剂量的95%置信限。 12.4
- 10.3 置信水平为95%时,微核率的置信限按照公式(6)计算: 95%置信水平微核率的置信限= 𝑝± 1.96𝑢(𝑝)…………………………………………… ( (6) 式中: p——微核率,(‟); 𝑢(𝑝)——微核率的不确定度,(‰)。 当置信限下限<0时,覆盖区间下限默认为0。 受照剂量的估算
- 10.4 将所要估算剂量的标本中得到的微核率及95%置信限的上下限代入建立的剂量-效应标准曲线,估算 出受照剂量。放射事故受照人员生物剂量估算示例参见附录C。 11 质量控制 进行微核标本制备与分析的实验室应有2 名(含)以上专业技术人员,掌握电离辐射生物效应和
- 11.1 细胞遗传学基础知识,熟练掌握显微镜下微核分析技术。每个微核需2 名专业技术人员相互确认。 标本应有唯一性编号,标本分析完毕后,应置于玻片盒内保存,并做好记录。
- 11.2 分析细胞数应满足本标准第6.1 条的要求。
- 11.3 正确使用本标准的说明参见附录D。
- 11.4 12 CB 微核法估算剂量的原则 事故后应尽早取血,不宜超过4 周。
- 12.1 培养条件、制片方法和微核的判断标准应与建立剂量-效应曲线时相同。对估算剂量的个体,至
- 12.2 少应分析500 个以上的双核淋巴细胞。对受照剂量较大的个体,如达不到上述细胞数,可全片计数所有 双核淋巴细胞。 应选择和事故条件接近的刻度曲线进行剂量估算,在曲线剂量范围内应用,不应外推。
- 12.3 估算剂量时,除给出平均值以外,同时给出剂量的95%置信限。
- 12.4
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GBZ/T 328—2023 6 A A 附 录 A (规范性) 主要仪器设备和试剂配制 A.1 主要仪器设备 A.1.1 超净工作台:用于细胞接种。 A.1.2 恒温培养箱:用于细胞培养。 A.1.3 普通水平式离心机:用于细胞分离。 A.1.4 光学显微镜:带坐标刻度,用于细胞观察。 A.1.5 冰箱:至少具备-20 ℃和4 ℃条件,用于储存实验用试剂。 A.1.6 水浴锅:用于细胞低渗。 A.1.7 通风橱或通风柜:用于实验中的排风。 A.2 主要试剂的配制 A.2.1 RPMI-1640培养基、低渗液、固定液、磷酸盐缓冲液和吉姆萨染液的配制参照GBZ/T 248的规定。 A.2.2 松胞素-B储存液:松胞素-B储存液应避光保存。松胞素-B的分子式为C29H37NO5,不溶于水,易溶 于二甲基亚砜,在培养体系中适宜的浓度可以抑制细胞运动和细胞质分裂,而不影响细胞核分裂。将松 胞素-B溶于二甲基亚砜中,浓度为2 mg/mL,-20 ℃储存,用前融化,生理盐水稀释,加入培养体系后的 终浓度为6 μg/mL。
- A.1 主要仪器设备
- A.1.1 超净工作台:用于细胞接种。
- A.1.2 恒温培养箱:用于细胞培养。
- A.1.3 普通水平式离心机:用于细胞分离。
- A.1.4 光学显微镜:带坐标刻度,用于细胞观察。
- A.1.5 冰箱:至少具备-20 ℃和4 ℃条件,用于储存实验用试剂。
- A.1.6 水浴锅:用于细胞低渗。
- A.1.7 通风橱或通风柜:用于实验中的排风。
- A.2 主要试剂的配制
- A.2.1 RPMI-1640培养基、低渗液、固定液、磷酸盐缓冲液和吉姆萨染液的配制参照GBZ/T 248的规定。
- A.2.2 松胞素-B储存液:松胞素-B储存液应避光保存。松胞素-B的分子式为C29H37NO5,不溶于水,易溶 于二甲基亚砜,在培养体系中适宜的浓度可以抑制细胞运动和细胞质分裂,而不影响细胞核分裂。将松 胞素-B溶于二甲基亚砜中,浓度为2 mg/mL,-20 ℃储存,用前融化,生理盐水稀释,加入培养体系后的 终浓度为6 μg/mL。
依据:PDF 第 9 页
原文条款与附录(PDF物理页10)
GBZ/T 328—2023 7 B B 附 录 B (资料性) 微核分析记录表和微核检测报告单 B.1 微核分析记录表 微核分析记录表(样式)见表B.1。 表B.1 微核分析记录表(样式) 显微镜编号: 第 页,共 页 检测方法: □常规培养微核法 □胞质分裂阻断微核法 编号 姓名 分析细胞数 微核坐标或图像文件名 分析日期 检测单位: 分析人: 复核人: 检测日期: 年 月 日 复核日期: 年 月 日 填表说明:发现微核后需填写微核细胞所在的横纵坐标刻度值和微核数量(如:6.6/136.5,1。“6.6/136.5” 为坐标值,“1”为微核数 )。有图像采集设备的机构,可代之以图片保存的文件名(命名格式:受检者姓名+ 图片编号,微核数。如:张三001,1),以便复核。
- B.1 微核分析记录表 微核分析记录表(样式)见表B.1。 表B.1 微核分析记录表(样式) 显微镜编号: 第 页,共 页 检测方法: □常规培养微核法 □胞质分裂阻断微核法 编号 姓名 分析细胞数 微核坐标或图像文件名 分析日期 检测单位: 分析人: 复核人: 检测日期: 年 月 日 复核日期: 年 月 日 填表说明:发现微核后需填写微核细胞所在的横纵坐标刻度值和微核数量(如:6.6/136.5,1。“6.6/136.5” 为坐标值,“1”为微核数 )。有图像采集设备的机构,可代之以图片保存的文件名(命名格式:受检者姓名+ 图片编号,微核数。如:张三001,1),以便复核。
依据:PDF 第 10 页
原文条款与附录(PDF物理页11)
GBZ/T 328—2023 8 B.2 微核检测报告单 微核检测报告单(样式)见表B.2。 表B.2 微核检测报告单(样式) 编号 姓名 性别 年龄 周岁 工种 工龄 检测方法: □常规培养微核法 □胞质分裂阻断微核法 结果: 微核数量: 个。 微核率(‟): 。 结果评价: 检测单位: 分析人: 复核人: 检测日期: 年 月 日 复核日期: 年 月 日
- B.2 微核检测报告单 微核检测报告单(样式)见表B.2。 表B.2 微核检测报告单(样式) 编号 姓名 性别 年龄 周岁 工种 工龄 检测方法: □常规培养微核法 □胞质分裂阻断微核法 结果: 微核数量: 个。 微核率(‟): 。 结果评价: 检测单位: 分析人: 复核人: 检测日期: 年 月 日 复核日期: 年 月 日
依据:PDF 第 11 页
原文条款与附录(PDF物理页12)
GBZ/T 328—2023 9 C C 附 录 C (资料性) 放射事故受照人员生物剂量估算应用示例 某人受 60Co γ射线一次全身照射,照后48h内取血,采用微量全血法培养淋巴细胞,分析800个双核 淋巴细胞,发现微核514个,估算其生物剂量。 每细胞微核数为0.6425×1000‟=642.5‟,微核率的不确定度为√ /800×1000‟=28.3‟。 微核率的95%置信限为642.5‟±1.96×28.3‟,即587.0‟~698.0‟。 根据本实验室所建立的 60Co γ射线照射离体血建立的CB微核剂量-效应曲线: Y = 17.9119+33.3838D+42.8809D 2,该曲线的剂量范围为0.1 Gy~5.0 Gy,剂量率为0.38 Gy/min,Y 为微核率(‟),D为剂量(Gy)。 将642.5‟、587.0‟和698.0‟分别代入Y项,解方程后求出平均剂量为3.45 Gy,下限为3.27 Gy, 上限为3.61 Gy,估算剂量结果均值为3.45Gy,95%置信水平的剂量范围为:3.27 Gy~3.61 Gy。
依据:PDF 第 12 页
原文条款与附录(PDF物理页13)
GBZ/T 328—2023 10 D D 附 录 D (规范性) 正确使用本标准的说明 D.1 本标准对常规培养微核和CB微核技术进行了规定,建议本标准的使用单位在放射工作人员的职业 健康检查中视本单位情况选择具体的培养方法,在应急剂量估算中采用CB微核法进行剂量估算。 D.2 静脉血的采集应在所有放射性检查前进行。 D.3 两种微核法的正常参考值个体差异较大,随年龄变化的波动也较大,各单位可参考本标准中规定 的正常参考值,也可根据本实验室的总结分析结果来确定其正常参考值。对于检测结果的判断,各单位 也可根据其确定的正常参考值进行判断是否异常。 D.4 微量全血培养过程的培养时间给出了时间段范围,各实验室可依据本实验室的具体情况而定。 D.5 本标准规定了标本制备过程中KCl低渗液的浓度、固定液成分和染色时间,各实验室可依据本实验 室的具体情况而定。 D.6 本标准第9 章给出了剂量-效应标准曲线的拟合包括一次方程或二次多项式,在实践应用中常用二 次多项式进行生物剂量估算。
- D.1 本标准对常规培养微核和CB微核技术进行了规定,建议本标准的使用单位在放射工作人员的职业 健康检查中视本单位情况选择具体的培养方法,在应急剂量估算中采用CB微核法进行剂量估算。
- D.2 静脉血的采集应在所有放射性检查前进行。
- D.3 两种微核法的正常参考值个体差异较大,随年龄变化的波动也较大,各单位可参考本标准中规定 的正常参考值,也可根据本实验室的总结分析结果来确定其正常参考值。对于检测结果的判断,各单位 也可根据其确定的正常参考值进行判断是否异常。
- D.4 微量全血培养过程的培养时间给出了时间段范围,各实验室可依据本实验室的具体情况而定。
- D.5 本标准规定了标本制备过程中KCl低渗液的浓度、固定液成分和染色时间,各实验室可依据本实验 室的具体情况而定。
- D.6 本标准第9 章给出了剂量-效应标准曲线的拟合包括一次方程或二次多项式,在实践应用中常用二 次多项式进行生物剂量估算。
依据:PDF 第 13 页
参考文献(PDF物理页14)
GBZ/T 328—2023 11 参 考 文 献 [1] ISO 17099:2014 Radiological protection - Performance criteria for laboratories using the cytokinesis block micronucleus (CBMN) assay in peripheral blood lymphocytes for biological dosimetry,ISO,2014. [2] IAEA. Cytogenetic dosimetry: applications in preparedness for and response to radiation emergencies - A Manual. Technical Document Publications, IAEA,Vienna 2011.
依据:PDF 第 14 页
公式(1)应分析细胞数
n为应分析的细胞数;p为微核率,计数分析一定数量细胞后获得。
依据:PDF 第 7 页
公式(2)线性剂量效应曲线
y为微核率(‰);a为本底微核率;b为回归系数;D为吸收剂量(Gy)。
依据:PDF 第 7 页
公式(3)二次多项式剂量效应曲线
y为微核率(‰);a为本底微核率;b、c为回归系数;D为吸收剂量(Gy)。
依据:PDF 第 7 页
公式(4)微核率
p为微核率(‰);x为检测到的微核数;n为分析的细胞数。
依据:PDF 第 7 页
公式(5)微核率不确定度
u(p)为微核率不确定度(‰);p为微核率(‰);n为分析的细胞数(变量说明续物理页8)。
依据:PDF 第 7 页;PDF 第 8 页
公式(6)95%置信限
p及u(p)单位均为‰;下限小于0时覆盖区间下限默认为0。
依据:PDF 第 8 页
表B.1 微核分析记录表(样式)
原文空白记录表;列出全部栏位,不填虚构结果。
| 字段 | 记录内容 |
|---|---|
| 显微镜/方法 | 显微镜编号、页码、常规培养或胞质分裂阻断法 |
| 分析记录 | 编号、姓名、分析细胞数、微核坐标或图像文件名、分析日期;多行空白记录 |
| 签署 | 检测单位、分析人、复核人、检测与复核日期 |
| 填表说明 | 发现微核后填写微核细胞坐标刻度值及微核数量;可用图像文件名留存 |
依据:PDF 第 10 页
表B.2 微核检测报告单(样式)
原文空白记录表;列出全部栏位,不填虚构结果。
| 字段 | 记录内容 |
|---|---|
| 人员资料 | 编号、姓名、性别、年龄、工种、工龄 |
| 检测方法 | 常规培养微核法或胞质分裂阻断微核法 |
| 结果 | 微核数量(个)、微核率(‰)、结果评价 |
| 签署 | 检测单位、分析人、复核人、检测及复核日期 |
依据:PDF 第 11 页
剂量效应曲线的样本和剂量点
低LET辐射剂量范围0.25 Gy~5.0 Gy、剂量率0.3 Gy/min~1.0 Gy/min,不少于8个剂量点,其中0.25 Gy~1.0 Gy内不少于4个;高LET辐射范围0.05 Gy~3.0 Gy。
依据:PDF 第 6 页
附录C生物剂量估算示例
60Co γ射线一次全身照射,48 h内取血,分析800个双核淋巴细胞发现514个微核:p=642.5‰,u(p)=28.3‰,95%置信限587.0‰~698.0‰。示例曲线Y=17.9119+33.3838D+42.8809D²(D为Gy),剂量范围0.1 Gy~5.0 Gy,剂量率0.38 Gy/min;估计剂量3.45 Gy,95%置信区间3.27 Gy~3.61 Gy。
依据:PDF 第 12 页
关键问题问答
职业健康检查和事故剂量估算怎样选择常规微核法或CB法?
本标准适用于放射工作人员职业健康检查微核检测,以及急性全身外照射受照人员的剂量估算。常规法采用微量全血培养后制片分析;CB法在第一次有丝分裂完成前加入松胞素-B阻断胞质分裂,只计数双核淋巴细胞中的微核。规范性附录D.1建议健康检查按本单位情况选方法,应急剂量估算采用CB法;不能把两种方法的细胞计数对象和参考范围混用。
依据:PDF 第 4 页,1;PDF 第 4 页,3.3~3.6;PDF 第 13 页,D.1
静脉血采集量、抗凝、保存温度和送检时限是什么?
采集静脉血约2 mL,肝素抗凝并颠倒混匀,最佳保存温度18~24 ℃,72 h内送达实验室。规范性附录D.2要求在所有放射性检查前采血。事故剂量估算另有第12.1条应尽早取血、不宜超过4周的要求,不能把72 h运输时限与事故后采血时间混为一项。
依据:PDF 第 5 页,4.2;PDF 第 13 页,D.2;PDF 第 8 页,12.1
微量全血培养配比、温度和两种方法的收获时间如何控制?
将0.3~0.5 mL静脉血加入4~5 mL含植物血凝素和10%~20%胎牛血清的RPMI-1640培养基,编号并记开始日期时间,轻摇混匀,在37 ℃±0.5 ℃培养。常规法68~72 h收获;CB法培养40~44 h时加入松胞素-B至终浓度6 μg/mL,继续至72 h收获。D.4说明实验室可根据具体情况确定所给时间段内的培养时间;剂量估算需与建曲线条件一致。
依据:PDF 第 5 页,4.3;PDF 第 13 页,D.4;PDF 第 8 页,12.2
常规法和CB法的KCl低渗浓度是否相同?
不同。每管加4 mL经37 ℃预温的KCl低渗液:常规法宜0.075 mol/L,CB法宜0.1 mol/L。轻吹均匀后立即加0.5~1 mL新配固定液(甲醇∶冰醋酸体积比3∶1),混匀转入10~15 mL离心管,水平离心8~10 min、离心力200~250 g。附录D.5允许实验室结合具体情况确定制备条件,但用于剂量估算时仍应保持与建曲线方法一致。
依据:PDF 第 5 页,5.1;PDF 第 13 页,D.5;PDF 第 7 页,10.1
低渗后固定、制片、编号和染色的关键步骤是什么?
弃上清、摇匀,加4.5 mL固定液固定20~30 min,再以200~250 g离心8~10 min;可用固定液洗涤减少杂质。按细胞量加数滴固定液混匀,滴于洁净干燥载玻片、室温干燥,每片编号记录。用体积比8%~10%的瑞氏-吉姆萨或吉姆萨染液染色8~10 min,轻洗、室温干燥。D.5允许依据实验室情况确定制备条件,不能据此取消编号记录。
依据:PDF 第 5 页,5.2~5.5;PDF 第 13 页,D.5
健康检查微核分析如何阅片,至少分析多少细胞?
第6.1条要求盲法阅片,按显微镜载物台坐标从右至左逐列或逐行扫描;常规法寻找转化的单核淋巴细胞,CB法寻找双核淋巴细胞,对每位受检者至少分析1000个转化淋巴细胞。第11.3条的质量控制再次要求满足6.1,不能用第12章事故CB剂量估算的特殊计数条款替代一般阅片要求。
依据:PDF 第 6 页,6.1;PDF 第 8 页,11.3
哪些形态条件才符合双核淋巴细胞判定?
两个核应各有完整核膜、位于同一细胞质边界内,大小、质感和染色强度大致相等;可完全分离或由核质桥连接,核质桥不超过核直径1/4。核重叠时应能看到各自完整核膜。细胞质边界或细胞膜应完整,并与相邻细胞清楚区分,不能仅见两个相邻核就记为一个双核细胞。
依据:PDF 第 6 页,6.2
如何区别微核、主核重叠和染料颗粒?
第6.3条要求微核游离于胞质,与主核完全分开,直径为主核的1/16~1/3,与主核不连接、不重叠;如重叠或相切,应能看到各自完整核膜。微核无折光性,颜色与主核相同或稍浅,应与染料颗粒等杂质区别。第3.2条还描述其为圆形或椭圆形小核,源于未随分裂进入子细胞的染色体断片或染色体。
依据:PDF 第 6 页,6.3;PDF 第 4 页,3.2
常规法与CB法微核率正常参考范围是多少,超出范围怎么办?
第7.1条规定常规法0~6‰、CB法0~30‰;单位是千分号,不能写成百分比。超出参考范围者可检查外周血淋巴细胞染色体畸变。规范性附录D.3说明个体及年龄差异较大,可采用标准参考范围,也可依据本实验室总结确定参考范围并判断异常;异常结果不等于自动确诊某种放射疾病。
依据:PDF 第 6 页,7.1~7.2;PDF 第 13 页,D.3
发现微核后应记录什么,检测报告是否要注明方法?
第6.4条要求记录显微镜坐标;有条件可拍照并记录图像文件名供复核。资料性表B.1列显微镜编号、检测方法、受检者编号姓名、分析细胞数、微核坐标或文件名、日期和分析复核人员;填表说明还要求记录微核数量。表B.2列检测方法、微核数量、微核率及结果评价等。每位受检者应出具报告,方法必须与计数对象和参考范围对应。
依据:PDF 第 6 页,6.4、8.1;PDF 第 10 页,表B.1及填表说明;PDF 第 11 页,表B.2
微核标本和原始资料保存多久,复核人员有什么要求?
检测微核标本保存两年,微核记录表等原始资料应长期建档并建立电子档案。实验室应至少有2名掌握相关基础知识和微核分析技术的专业人员,每个微核需2名专业人员相互确认;标本需唯一编号,分析后放入玻片盒保存并记录。标本保存两年不能理解为原始记录两年后即可销毁。
依据:PDF 第 6 页,8.2;PDF 第 8 页,11.1~11.3
建立剂量效应曲线的志愿者和血样需符合什么条件?
采血前取得知情同意。选择2~4名健康、非放射工作的成年人,男女各半,18~60岁,无烟酒嗜好;半年内无急慢性疾病史、射线及化学毒物接触史,近一个月无病毒感染史。抽静脉血6~8 mL加入肝素抗凝管。该采血量用于建曲线,不能与第4.2条受检者约2 mL采血量混用。
依据:PDF 第 6 页,9.1;PDF 第 5 页,4.2
低LET辐射建曲线的剂量范围、剂量率和点数是什么?
应提供可靠明确的物理剂量并保证均匀照射;有条件时建立不同辐射类型和低LET不同剂量率的曲线。低LET剂量范围0.25~5.0 Gy,剂量率0.3~1.0 Gy/min,不少于8个剂量点,其中0.25~1.0 Gy内不少于4点;示例点为0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 Gy。原生文本的“1.O”经原图确认是数值1.0。
依据:PDF 第 6 页,9.2.1
高LET辐射剂量曲线能直接套用低LET的剂量点吗?
第9.2.1条为高LET单独给出0.05~3.0 Gy范围,可选0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 Gy。不能把低LET的0.25~5.0 Gy范围直接替代这一范围。照射后的培养同第4章,制片分析记录按第5、6章执行。
依据:PDF 第 6 页,9.2.1~9.2.3
各剂量点应分析的细胞数按什么公式确定?
第9.2.4条指向式(1):n=(1−p)×96.04/p,n为应分析细胞数,p为微核率,可先计数一定数量细胞求得。公式跨至下一物理页;代入前应明确微核率的数值表示,不能将“每千细胞微核数”的‰数值未经量纲处理直接代入含1−p的公式。标准未在式(1)下另行明确p的数值尺度,这一使用边界应保留。
依据:PDF 第 6 页,9.2.4;PDF 第 7 页,式(1)
X或γ射线微核剂量效应关系采用什么模型?
第9.3条列一次模型y=a+bD和二次模型y=a+bD+cD²。y为微核率(‰),a为本底微核率,b、c为回归系数,D为吸收剂量(Gy)。规范性附录D.6说明实践中常用二次多项式。所估剂量样品的制片方法应与建立曲线的方法相同,不能仅复制其他实验室系数而忽略方法条件。
依据:PDF 第 7 页,9.3、10.1;PDF 第 13 页,D.6
微核率及不确定度怎样计算,为什么必须区分比例与千分率?
第10.2条在分析细胞足够多(一般≥1000)、检测值符合泊松分布的条件下,用微核数x及分析细胞数n计算微核率,式(4)为p=x/n×1000‰。式(5)在原图写为u(p)=√(p/n)×1000‰,其p符号又被标为微核率(‰),比例与千分率的代入尺度需注意。附录C给出的明确计算是√514/800×1000‰=28.3‰;不能把642.5这一千分率数值再次当成无量纲比例代入根号。此处按原文及例题呈现,不补造统一单位约定。
依据:PDF 第 7 页,10.2、式(4)~(5);PDF 第 8 页,式(5)变量续;PDF 第 12 页,附录C计算
95%微核率置信限为负时如何处理,怎样换成剂量区间?
式(6)为p±1.96u(p),置信水平95%;下限小于0时,覆盖区间下限默认为0。将微核率及95%置信限的上下限分别代入已建立的剂量效应曲线,估算剂量及区间。不能只报告点估计;第12.4条要求同时给出平均值和剂量95%置信限。
依据:PDF 第 8 页,10.3~10.4;PDF 第 8 页,12.4
事故CB剂量估算的取血、细胞数和曲线外推有什么限制?
事故后尽早取血,不宜超过4周。培养、制片及微核判断应与建曲线时相同;第12.2条原文为“至少应分析500个以上”的双核淋巴细胞,高剂量个体达不到该数时可全片计数所有双核细胞。应选择接近事故条件的刻度曲线,只在曲线剂量范围内应用,不应外推。该条是事故CB估算原则,不可直接取消第6.1条一般分析至少1000细胞的要求。
依据:PDF 第 8 页,12.1~12.4;PDF 第 6 页,6.1
实验室需要哪些主要仪器,哪些规格不能遗漏?
规范性附录A.1列超净工作台、恒温培养箱、普通水平式离心机、带坐标刻度的光学显微镜、至少具备−20 ℃和4 ℃条件的冰箱、水浴锅以及通风橱或通风柜,分别服务于接种、培养、分离、观察、试剂储存、低渗及排风。显微镜坐标刻度与后续微核位置记录和复核相衔接。
依据:PDF 第 9 页,A.1
松胞素-B储存液如何配制、保存并加入培养体系?
规范性附录A.2.2指出松胞素-B不溶于水、易溶于二甲基亚砜,应将其溶于二甲基亚砜至2 mg/mL,避光、−20 ℃储存,用前融化并以生理盐水稀释,培养终浓度6 μg/mL。RPMI-1640、低渗液、固定液、磷酸盐缓冲液和吉姆萨染液配制参照GBZ/T 248。储存液2 mg/mL与培养终浓度6 μg/mL不能互换。
依据:PDF 第 9 页,A.2
附录C的800细胞、514微核实例怎样给出剂量及区间?
资料性附录C设定一次全身⁶⁰Co γ照射后48 h内取血,分析800个双核淋巴细胞发现514个微核;微核率642.5‰,不确定度28.3‰,95%置信限587.0~698.0‰。示例实验室曲线Y=17.9119+33.3838D+42.8809D²,适用0.1~5.0 Gy、剂量率0.38 Gy/min;分别代入后均值3.45 Gy、95%剂量范围3.27~3.61 Gy。它是特定曲线示例,不是所有实验室的通用校准方程。
依据:PDF 第 12 页,附录C;PDF 第 8 页,12.3
来源与版本
卫健委详情显示发布日期2023-03-07、实施日期2023-09-01;本轮未独立核验当前现行性。
资料获取时间:2026-09-29T02:39:39+08:00。PDF:14 页。
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