单细胞凝胶电泳用于受照人员剂量估算技术规范
规定单细胞凝胶电泳检测人外周血淋巴细胞 DNA 损伤、建立剂量与时间响应曲线的完整流程，包括样品分离、电泳、图像采集、供血者筛选、照射条件、模型拟合和附录 A 细胞数计算。只适用低 LET X/γ 射线一次性急性外照射后 72 h 内的早期 DNA 损伤；标准现行状态未核实。
标准解读
前言与制定依据
根据《中华人民共和国职业病防治法》制定，按 GB/T 1.1—2009 起草；前言列出提出、批准、起草单位和起草人。
依据：PDF 第 3 页，前言
1 范围
建立人外周血淋巴细胞 DNA 损伤的剂量-响应与时间-响应曲线；适用于低 LET 的 X 或 γ 射线一次性急性外照射后 72 h 以内的早期 DNA 损伤检测。
不适用于高 LET、慢性职业受照、非均匀照射、内照射人群的生物剂量估算，也不适用于事故受照者远期随访。
依据：PDF 第 4 页，1
2 术语和定义
单细胞凝胶电泳（彗星分析）是在单细胞分子水平定量分析细胞 DNA 残留损伤的方法。
Olive 尾矩（OTM）为尾部 DNA 百分含量与头、尾部重心间距离的乘积。剂量-响应曲线用受照反应与剂量的定量关系估算剂量；时间-响应曲线与剂量-响应曲线结合，减少 DNA 损伤修复对估算的影响。
依据：PDF 第 4 页，2
3.1 淋巴细胞分离
0.5 mL 离心管内预置 0.2 mL、4 ℃ 预冷的分离液，沿管壁加入 0.1 mL 外周血；3 500 r/min 离心 2 min。转移淋巴细胞层，加 PBS 至 2 mL，1 500 r/min 离心 6 min；弃上清并重复洗涤 2 次。最终浓度调为 2×10⁴/mL，4 ℃ 保存备用。
依据：PDF 第 4 页，3.1
3.2 铺胶
用 0.75% 正常熔点琼脂糖铺第一层，取 100 μL，凝固前 10 s 内铺匀并在 4 ℃ 固化 1 min；25 μL 淋巴细胞悬液与 75 μL 0.75% 低熔点琼脂糖混合铺第二层，4 ℃ 固化 1 min。
依据：PDF 第 5 页，3.2
3.3 裂解和电泳
新鲜中性裂解液 4 ℃ 裂解 1.5 h；双蒸水漂洗后，置 4 ℃ 的 0.5% TBE 电泳液中静置 20 min，再以 20 V、200 mA 电泳 20 min。
依据：PDF 第 5 页，3.3
3.4 染色和观察
用 2 μg/mL 溴化乙锭染色后漂洗，在荧光显微镜下采集图像；样品细胞数可按附录 A 计算，但至少 50 个彗星图像，实验至少重复 3 次。
依据：PDF 第 5 页，3.4
3.5—3.6 细胞选择与定量
只选择头、尾荧光清晰、无重叠和杂质干扰的彗星细胞。彗星细胞率 p 为彗星细胞数除以观察细胞总数，按百分数表示；以软件计算 Olive 尾矩表征 DNA 损伤。
依据：PDF 第 5 页，3.5；PDF 第 5 页，3.6
4.1 对供血者要求
男女各 1 人，18～60 岁；无肿瘤、慢性病、有毒有害物质接触和大剂量放射诊断或治疗史；不吸烟、不酗酒。
依据：PDF 第 5 页，4.1
4.2—4.3 细胞照射与电泳
凝胶包埋淋巴细胞均匀照射 0.1～5.0 Gy；至少 7 个均匀分布的剂量点，其中低于 0.5 Gy 的点选 2～3 个。冰上照射，照后立即裂解；电泳按第 3 章执行。
依据：PDF 第 5 页，4.2；PDF 第 5 页，4.3
4.4 剂量-响应曲线拟合
直线趋势用 Y=c+αD；抛物线趋势用 Y=c+αD+βD²。Y 为 Olive 尾矩，c 为自发 DNA 损伤，α、β 分别对应一次和二次击中导致的 DNA 损伤，D 为照射剂量（Gy）。
用拟合优度 R² 和 p 值选模型；p<0.05 视为有统计学意义，R² 越接近 1 拟合越好。
依据：PDF 第 5 页，4.4；PDF 第 6 页，4.4
5.1—5.2 供血者与血样照射
供血者要求同 4.1；0.5 mL 抗凝人外周血均匀照射 2.0 Gy，温度 37±0.5 ℃，照后于同温培养。
依据：PDF 第 6 页，5.1；PDF 第 6 页，5.2
5.3 培养方法
观察 0.5～72 h，至少 7 个时间点。无菌条件下把照后全血接种于 pH 6.8～7.2、含适量抗生素和胎牛血清的 5 mL RPMI-1640 培养体系，37 ℃ 培养至各时间点再做单细胞凝胶电泳。
依据：PDF 第 6 页，5.3
5.4 时间-响应曲线拟合
直线趋势用 Y=c+αT；抛物线趋势用 Y=c+αT+βT²。T 是照后时间（h），其他变量含义同剂量曲线。
依 R² 和 p 值选模型，p<0.05 视为有统计学意义，R² 越接近 1 拟合越好。
依据：PDF 第 6 页，5.4；PDF 第 6 页，5.4
附录 A（资料性）观察细胞数
预实验估计彗星细胞率 p；用二项式分布的 95% 置信限和 15% 允许误差求观察细胞数 n。式（A.1）为 p±1.96√[p(1−p)/n]，式（A.2）令 1.96√[p(1−p)/n]=p×15%，式（A.3）得 n=(1−p)×170.74/p。p 为彗星细胞率，n 为应观察细胞数。
依据：PDF 第 7 页，A
关键问题问答
适用于哪些受照情形？
仅针对低 LET X 或 γ 射线一次性急性外照射后 72 h 内的早期 DNA 损伤检测；列明的高 LET、慢性职业受照、非均匀和内照射等情形不适用。
依据：PDF 第 4 页，1；PDF 第 4 页，1
剂量曲线和时间曲线如何配合？
剂量曲线以 D（Gy）拟合，时间曲线以照后 T（h）拟合；应结合使用以减少 DNA 损伤修复对估算的影响。
依据：PDF 第 4 页，2.4；PDF 第 5 页，4.4；PDF 第 6 页，5.4
每份样品至少采集多少图像？
至少 50 个彗星图像，实验至少重复 3 次；观察细胞总数也可按附录 A 公式计算。
依据：PDF 第 5 页，3.4；PDF 第 7 页，A
来源与版本
已核对官方详情页的发布日期和实施日期，但未找到当前有效状态的明确官方标示，状态保留 unknown。
资料获取时间：2026-09-29T07:00:02+08:00。PDF：7 页。